生物學領域一直都是科學家們研究的重點，要想發(fā)展生物學領域，檢測儀器儀表的革新十分的重要，未來冷凍電鏡也許并不會成為科研人員的第一選擇。

在英國劍橋市一座鋼結構建筑深處的地下室里，一場大規(guī)模的“叛亂”正在上演。

一個約3米高的龐大金屬箱正通過消失在屋頂上的橙色粗電纜，靜悄悄地發(fā)射兆兆字節(jié)的數(shù)據(jù)。這是全球最先進的冷凍電子顯微鏡之一：一臺利用電子束為冷凍的生物分子成像并揭秘其分子形狀的設備。英國醫(yī)學研究委員會分子生物學實驗室（LMB）結構生物學家SjorsScheres像個矮子一樣站在這臺價值500萬英鎊（合770萬美元）的設備旁邊介紹說，這臺顯微鏡非常敏感，以至于一個叫喊聲就能毀掉試驗。

在全球實驗室中，類似這樣的冷凍電鏡正影響著結構生物學領域。過去3年里，它們揭示了制造蛋白的核糖體細節(jié)，而這些發(fā)現(xiàn)正在以飛快的速度發(fā)表于頂級期刊。結構生物學家們毫不夸張地認為，他們的領域正處于一場革命當中：冷凍電鏡能快速創(chuàng)建那些抗拒X射線結晶學和其他方法的分子的高分辨率模型。與此同時，利用此前技術獲得諾貝爾獎的實驗室正爭先恐后地學習這種“新貴”方法。

挑戰(zhàn)“王者”

當1973年生物學家RichardHenderson到LMB研究一種被稱為菌視紫紅質的蛋白時，利用光能量推動質子穿過細胞膜的X射線結晶學是毫無疑問的“王者”。Henderson和他的同事NigelUnwin利用這種蛋白制成二維晶體，但它們并不適合X射線衍射。因此，兩人決定嘗試電子顯微鏡。

當時，電子顯微鏡用于研究被重金屬染色劑處理過的病毒或組織切片。一束電子被射向樣品，其中掙脫開來的電子被探測到并用于描繪它們所撞入的材料結構。這種方法產(chǎn)生了煙草病菌的首幅清晰圖像，但染色劑使觀察單個蛋白變得困難，更不用說X射線所能揭示的原子水平上的細節(jié)。

在一個關鍵步驟中，當Henderson和Unwin利用電子顯微鏡對菌視紫紅質的晶片進行成像時，他們省略了染色劑，相反把晶體放在金屬網(wǎng)格上，以便使蛋白凸顯出來。“你能看到蛋白中的原子。”和Unwin在1975年發(fā)表了菌視紫紅質結構的Henderson介紹說。“這是一個巨大的進步。”美國加州大學舊金山分校細胞生物學家DavidAgard表示，“這就是說，利用電子顯微鏡研究蛋白結構將成為可能。”

冷凍電鏡領域在上世紀八九十年代得到發(fā)展。一個關鍵進步是將液態(tài)乙烷用于瞬間凍結溶液中的蛋白并使其保持靜止。不過，通常情況下，這種技術仍然只能將蛋白結構解析到10埃（1埃相當于1納米的十分之一）的分辨率——與X射線晶體學超過4埃的模型相比并沒有競爭力，并且遠遠無法滿足將這些結構用于藥物設計的要求。當諸如美國國立衛(wèi)生研究院等資助者把上億美元投資到野心勃勃的晶體學項目時，對冷凍電鏡的資助遠遠落后于此。1997年，當Henderson參加關于3D電子顯微鏡的年度高登研究會議時，一位同事在開幕式上發(fā)表了頗有挑釁意味的聲明：冷凍電鏡是一種“小生境”方法，不可能取代X射線晶體學。不過，Henderson能看到一個不同的未來，并且在隨后的演講中進行了反駁。“當時我說，我們應當讓冷凍電鏡在全球統(tǒng)治所有結構學方法。”他回憶道。

革命從此開始

此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實現(xiàn)了各種技術改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數(shù)碼相機風靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專家仍然偏好過時的膠片，因為它能比數(shù)字傳感器更高效地記錄電子。不過，和顯微鏡生產(chǎn)廠商一道，研究人員開發(fā)出遠超膠片和數(shù)碼相機探測器的新一代直接電子探測器。

這些從2012年左右獲得應用的探測器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時，諸如Scheres等研究人員編寫了復雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉變成在很多情況下可與晶體學解析的分子圖像質量相媲美的3D模型。

冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會四處晃動的穩(wěn)定、大型分子，因此通常由幾十個蛋白制成的分子機器是很好的目標。而研究證明，沒有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過X射線晶體學解析核糖體結構的方法，讓3位化學家獲得了2009年諾貝爾化學獎。過去幾年里，不同的研究團隊迅速發(fā)表了來自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結構，包括首個人類核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎的VenkiRamakrishnan領導的LMB實驗室，X射線晶體學在很大程度上變得無人問津。他認為，對于大型分子來說，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學技術的預測是可靠的”。

今年5月，加拿大多倫多大學結構生物學家JohnRubinstein和他的同事利用約10萬幅冷凍電鏡圖像，創(chuàng)建了一種名為V-ATPase、形狀類似轉子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過燃燒三磷酸腺苷（ATP）推動質子進出細胞液泡。“我們看到的是一切事情都在靈活進行。”Rubinstein說，“它在彎曲、扭動和變形。”在他看來，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。

統(tǒng)治結構生物學領域

像任何新興領域一樣，冷凍電鏡領域也有著成長的煩惱。一些專家擔心，競相利用此項技術的研究人員會產(chǎn)生有問題的結果。2013年發(fā)表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結構，便受到科學家的質疑。他們認為，用于構建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團隊產(chǎn)生的X射線和冷凍電鏡模型對原始模型提出了挑戰(zhàn)，但這些研究人員一直堅守他們的成果。

今年6月，在高登會議上，想要更多質量控制的研究人員通過一項決議，督促各期刊為審稿人提供關于冷凍電鏡結構如何被創(chuàng)建的細節(jié)資料。

成本也會減緩此項技術的擴散。據(jù)Scheres估算，LMB每天花費約3000英鎊運行其冷凍電鏡設備，還要加上1000英鎊的電費。大部分電費是由儲存和處理圖像所需的計算機產(chǎn)生的。“對于很多實驗室來說，這是一項很高的開支。”

為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預定時間的共享設備?；羧A德·休斯醫(yī)學研究所（HHMI）在其弗吉尼亞州珍利亞農(nóng)場校區(qū)運營著一個對HHMI資助的研究人員開放的冷凍電鏡實驗室。在英國，由政府和惠康基金會資助的一臺全國性冷凍電鏡設備，今年在牛津附近的迪德科特開始運行。“人們想要了解冷凍電鏡，已成為當下的一股浪潮。”幫助建立上述設備的倫敦大學伯克貝克學院結構生物學家HelenSaibil表示。

追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學生物物理學家RodMacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結構而共同分享了2003年諾貝爾化學獎，但如今卻在深入研究冷凍電鏡。“我正處在學習曲線的陡坡上，而這總是令我興奮不已。”MacKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開和關閉的。

當Henderson在1997年反駁說冷凍電鏡將統(tǒng)治結構生物學世界時，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預言已不像當時看上去的那么夸張。“如果繼續(xù)發(fā)展下去，并且所有技術問題都得到解決，冷凍電鏡確實會成為一種占據(jù)統(tǒng)治地位的技術，而不僅僅是第一選擇。”Henderson說，“我們或許已經(jīng)成功了一半。”

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